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人血清白蛋白—人粒细胞集落刺激因子(Ⅰ)融合蛋白的表达与纯化及GMP生产.pdf
人粒细胞集落刺激因子HGCSF在肿瘤放疗、化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血、放射病等血液病的治疗及骨髓移植方面具有重要作用，现已应用于临床，是每年销售额最大的几个生物制品药物之一。HGCSF的最大缺陷是在血浆中半衰期较短。为了延长HGCSF半衰期，本文成功利用甲醇酵母表达系统开发了人血清白蛋白和粒细胞集落刺激因子融合蛋白RHSAGCSF作为长效的基因工程药物。首先用PCR方法将HSA和HGCSF两个片段连接，再克隆到酵母分泌型表达载体PPIC9中，经酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合。基因工程菌经发酵罐培养表达、层析法分离纯化得到融合蛋白。纯化后的融合蛋白经印迹分析WESTERNBLOT表明同时具有HSA和GCSF的免疫原性，且稳定性增加，半衰期大大延长，达到25～30H，是GCSF单体血浆半衰期的15～20倍同时体外生物学活性分析表明，经融合修饰的GCSF的活性仍保留有GCSF单体的50％以上。与AMGEN等公司使用聚乙二醇PEG共价修饰蛋白质GCSF相比，HSA融合的GCSF具有相似的半衰期和生物活性。同时，融合表达的方法具有更简便的生产过程和更低的生产成本的优势。在临床应用时，这种长效GCSF很可能代替单体的GCSF。
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